Diese Methode wird heutzutage in der molekulargenetischen Diagnostik überwiegend für die Bestimmung der Anzahl sehr großer (z.B. >110 CTG- Trinukleotid-) Repeat-Expansionen/Kontraktionen und/oder für die Untersuchung des DNA-Methylierungsstatus verwendet. Genomische DNA wird mit (methylierungssensitiven) Restriktionsenzymen (abhängig von der DNA-Sequenz, die untersucht werden soll) verdaut. Die verdaute DNA wird mittels Agarosegelelektrophorese nach Größe getrennt und im eigentlichen Southern-Blot-Verfahren auf eine Nylonmembran übertragen. Anschließend erfolgt die Hybridisierung der auf der Nylonmembran fixierten DNA mit einer (herkömmlich radioaktiv, zunehmend nichtradioaktiv) markierten Sonde. Die Detektion erfolgt bei nichtradioaktiven Verfahren indirekt über einen fluoreszenzmarkierten Antikörper nach Auflegen eines Röntgenfilmes auf die Nylonmembran. Das Bandenmuster kann anhand des geschwärzten Filmes ausgewertet und interpretiert werden.
Die Southern-Blot-Analyse wird u.a. bei der molekulargenetischen Analyse von Triplett-Repeat -Erkrankungen, wie Myotone Dystrophie Typ 1 angewandt, um z.B. die Größe einer sehr großen Triplett-Repeat-Verlängerung (>110 CTG) zu bestimmen, die mit der Fragmentlängenanalyse mittels Kapillarelektrophorese nicht möglich ist. Zudem kann beispielsweise im Rahmen der Untersuchung des Fragilen X-Syndroms geklärt werden, ob die Triplett-Repeat-Verlängerung die Methylierung der betroffenen Region bewirkt, was letztlich zu einer Hemmung der Transkription und damit zum Ausfall des FMR1-Genprodukts führt. Es handelt sich um eine (Zeit-) aufwändige aber robuste Methode in der genetischen Diagnostik, die bereits seit vielen Jahrzehnten angewandt wird. Bei manchen Indikationen ist der Einsatz verschiedener Restriktionsenzyme und Sonden notwendig. Es kann nur eine ungefähre Angabe der Triplett-Zahl erfolgen. Die Interpretation der detektierten Banden setzt oft ein Expertenwissen voraus.