Methoden & Technologien

Cell-free DNA-Analyse
cfDNA-Analyse

DNA ist hauptsächlich im Kern von Zellen lokalisiert, wo sie in linearer Form in Proteinkomplexen vorliegt. Für die Analyse dieser DNA ist ein Zellaufschluss mit anschließender DNA-Aufreinigung notwendig. Im Blutkreislauf eines jeden Menschen findet sich jedoch auch DNA, die nicht in Zellkernen verpackt vorliegt, sondern in zellfreier Form vorhanden ist. Diese zellfreie DNA (engl. cell free DNA; cfDNA) kann durch eine einfache Blutplasmaabtrennung ohne Zelllyse gewonnen werden.

cfDNA im Blut stammt aus dem im menschlichen Körper ubiquitär stattfindenden programmierten Zelltod (Apoptose), durch den genomische DNA zuerst fragmentiert und später aus der absterbenden Zelle sekretiert wird. Neben Fettzellen (Adipozyten) durchlaufen auch plazentare Trophektodermzellen, eventuell vorhandene Tumorzellen und auch Transplantatzellen die Apoptose und sind somit in der cfDNA repräsentiert. Diese Fraktion der „Fremd“-cfDNA kann trotz ihres geringen Anteils im Blut auf plazentare Aneuploidie, krebsspezifische Varianten und Graft-versus-Host-Disease (GvHD) analysiert werden.

Zur Untersuchung von zellfreier DNA können beispielsweise folgende Methoden verwendet werden:

Real-time PCR

Gezielter Nachweis von pathogenen Varianten durch Allel-spezifische Sonden, speziell bei Genen auf dem Y-Chromosom, und Nachweis von Duplikationen/Deletionen durch relative Quantifizierung.

Droplet-Digital-PCR (ddPCR)

Diese PCR-Form bedient sich der massiven parallelen Kompartimentierung eines PCR-Ansatzes in Öl-Tröpfchen, die eine limitierende Verdünnung des Ausgangsmaterials erzeugt. Dadurch wird eine sehr hohe Sensitivität gewährleistet, die im Rahmen der cfDNA-Analyse eine absolute Quantifizierung erlaubt. Eine Unterscheidung zwischen mütterlicher und plazentarer cfDNA ist damit möglich. Sie dient zum Nachweis von Punktmutationen, Kopienzahlvariationen (CNV), Heterozygotie-Verlust und Aneuploidie.

Shotgun-Sequencing

Wie die ddPCR eignet sich auch die Shotgun-Sequenzierung auch zum Nachweis von Punktmutationen, Kopienzahlvariationen (CNV), Heterozygotie-Verlust und Aneuploidie in der zellfreien DNA. Die Gesamtgenom-Sequenzierung eines plazentaren Genoms ist mit dieser Methode ebenfalls möglich.

Massenspektrometrie

Mittels MALDI-TOF MS können Punktmutationen in der cfDNA sequenziert werden. Dazu hybridisiert ein Oligonukleotid direkt vor der Punktmutation und wird um ein einzelnes Nukleotid verlängert (sog. Einzelnukleotid-Sequenzierung). Durch die Detektion von Massenunterschieden können homozygote und heterozygote Basenpaarpositionen unterschieden werden.

Lochhamer Str. 29
82152 Martinsried

Kontakt

Service
Genetische Beratung
Unternehmen
Alle Rechte vorbehalten © Medicover Diagnostics
|